Illumina 发布开源模型 SpliceAI2，从 DNA 序列预测剪接与完整转录本

应对人类遗传学的巨大复杂性

在人类基因组计划之前，科学家通常认为生物复杂性与基因数量相关，估计人类可能有 50,000–100,000 个蛋白质编码基因¹。然而，人类基因组计划揭示了一个令人惊讶的小数字，最终确定在约 20,000 个，由此产生了 G 值悖论：基因数量与生物体复杂性之间的脱节²。事实上，杂货店里常见的香蕉品种大约有 36,000 个蛋白质编码基因，比看似更复杂的人类多 80%³。

二十年后，我们现在明白基因数量只讲述了故事的一小部分。人类的复杂性源于丰富的调控景观，它决定了基因如何、在哪里以及何时表达，以及单个基因如何产生多种结果。RNA 剪接是生物体实现惊人复杂性的一种显著机制：通过允许一个基因产生多个不同的转录本和蛋白质，它极大地扩展了相对少量基因的功能库⁴。

身兼多职：理解单个基因如何执行多种功能

今天，BioInsight AI Lab 推出了 SpliceAI2（详见我们的论文），这是一个新的预训练 AI 模型，旨在帮助研究人员研究可变剪接。超过 95% 的人类基因经历可变剪接，表明其在影响从蛋白质活性的轻微修改到完全相反的分子角色等令人难以置信的功能多样性方面几乎无处不在⁴。

可变剪接实例

BCL2L1 是一个参与正常细胞凋亡过程的基因。然而，先前的研究发现，BCL2L1 由于剪接产生长（BCL-xL）和短（BCL-xS）异构体，两者具有相反的功能⁵。尽管 BCL-xS 具有促凋亡作用，但几种癌症促进 BCL-xL 异构体，后者通过阻止线粒体释放细胞色素 c 并阻断像 Bax 这样的促凋亡蛋白，充当细胞存活因子⁵。

这种剪接活动是发育的基本组成部分，在个体的一生中至关重要。它也在包括癌症在内的多种疾病中发生改变⁵。鉴于与可变剪接相关的关键调控变化的惊人多样性，BioInsight AI Lab 多年来一直致力于开发工具，帮助研究人员研究剪接变体如何影响关键生物学⁶。

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介绍 SpliceAI2：更全面地理解剪接机制

SpliceAI2 接替了 BioInsight AI Lab 于 2019 年发布的原始 SpliceAI⁶。该模型成为转化基因组学研究中使用最广泛的工具之一，被超过 3,400 篇出版物引用。最初的 SpliceAI 模型有效地回答了一个关键问题。细胞是否会在给定位置进行剪接？

SpliceAI2 帮助回答三个关键问题：

剪接位点 – 基因中哪些位置被用作剪接位点，以及它们被使用的频率如何？
剪接连接 – 在 RNA 剪接过程中，哪些剪接位点相互连接？
完整转录本 – 给定这些剪接位点和连接点，会产生哪些全长 RNA 转录本异构体？

原始的 SpliceAI 仍然是一个强大的工具，因为知道剪接位点发生的位置是调控谜题的重要一环。然而，它并不能揭示这些位点如何连接，也无法预测细胞最终产生的 RNA 转录本。因此，SpliceAI2 的设计目标是超越剪接位点检测，通过预测剪接位点如何经由剪接连接点相连，并重建由 DNA 序列生成的完整转录本异构体。这些能力结合起来，为遗传变异如何塑造基因执行往往意想不到的功能的能力提供了远为全面的视角。

重要的是，运行 SpliceAI2 所需的全部就是一段 DNA 序列。该模型的构建基于这样一个认识：DNA 测序在转化研究中很常见，其目标是帮助研究人员避免自行生成长读长 RNA 数据的成本和复杂性。它还解决了基于 RNA 的方法的一个关键局限，即组织可及性。许多基因在血液中的表达水平不足以可靠地测量剪接，这意味着研究人员可能需要来自难以获取的组织的 RNA 来评估潜在的剪接改变变异。通过直接从 DNA 序列预测转录本后果，SpliceAI2 使得无需获取基因表达所在的组织即可进行转录本水平的分析。

SpliceAI2 是如何构建的：AI 的价值取决于其训练所用的数据

SpliceAI2 的进步主要来自其训练数据的广度和多样性。与原始 SpliceAI 训练数据集相比，SpliceAI2 使用的训练数据集大 100 多倍。更新后的训练数据包括来自十个物种的 314,745 个 RNA 测序样本，经过滤后覆盖超过 4600 万个观测到的剪接连接点。通过汇集数十万次 RNA 测序实验，该模型实际上从一个相当于超深度 RNA-seq 数据集的数据中学习，不仅捕捉常见的剪接连接点，还捕捉许多仅被很少使用的连接点。这些不频繁的剪接事件在单个研究中可能难以观察到，但 collectively 提供了关于剪接生物学全谱的宝贵信息。

从这个更丰富的剪接位点和连接点目录中学习，显著提高了模型预测剪接结果的能力。这第一组训练数据来源于数十万个公开可用数据集中的一个高度相关的子集。这对于 SpliceAI2 的前两个功能至关重要，即剪接位点预测和剪接连接点使用预测。

第三个功能是预测完整的转录本异构体，它受益于另一种类型的训练数据。传统的短读长测序以片段形式捕获遗传信息，这对于识别单个剪接位点非常出色，但在确定哪些剪接事件属于同一个完整转录本时可能有所局限。相比之下，长读长测序能够端到端地捕获转录本。为了实现转录本级别的预测，BioInsight AI Lab 在来自公共 ENCODE 项目的 330 个长读长样本上训练了 SpliceAI2。这一补充使 SpliceAI2 能够学习单个剪接事件如何组合形成完整转录本，并使模型能够在训练期间从未见过的基因上以 82% 的概率重建出最常见的单一转录本，而仅使用短读长数据训练时这一比例为 78%。

模型性能：在每一项测试中都更准确

为了确定 SpliceAI2 与其他分析工具的对比情况，BioInsight AI Lab 在三个独立的基准数据集上将模型与原始 SpliceAI、Pangolin 以及 Google DeepMind 的 AlphaGenome 进行了比较。与 AlphaGenome 的比较由牛津大学的学术合作者独立运行。

SpliceAI2 在所有测试基准中都实现了最高的准确率和最强的性能。具体而言，它在识别产生全新剪接位点的变异方面是最准确的模型，在内含子深处位置的变异上观察到的提升最大。它还在多个方面优于其他方法。首先，它更准确地预测了剪接位点被使用的强度，而不仅仅是它是否存在。其次，它识别出了在自然群体中驱动剪接差异的变异。最后，它的预测与一项大规模实验研究的结果相符，该研究直接测量了数十万个突变的剪接效应（图 1）。

对遗传病研究的影响：超越蛋白质编码区域

SpliceAI2 研究中最具影响力的发现之一来自对 Genomics England 100,000 Genomes Project 的分析，这是一项旨在更好地理解罕见病遗传基础的大规模工作。研究人员检查了来自 7,504 名个体的具有丰富表型信息的样本，并提出了一个简单的问题。如果 SpliceAI2 预测某个变异会改变剪接，那么这些变异是否更可能出现在已与个体所观察到的表型相关联的基因中？

为了严谨地回答这个问题，团队在参与者之间反复打乱表型分配并重新运行分析，从而建立仅由偶然因素导致的基线预期。SpliceAI2 优先排序的变异在生物学相关基因中显著富集。在匹配的置信度阈值下，SpliceAI2 识别出的疾病相关变异比任何其他测试的剪接模型多 17%。SpliceAI2 也优于旧版 SpliceAI 模型，在 2 倍置信区间下发现的疾病相关剪接变异多 33%，在 4 倍置信区间下多 66%（图 2）。最强的富集出现在已知对功能缺失高度敏感的基因中，这表明该模型正在识别具有重要生物学后果的剪接破坏性变异。

也许更能说明问题的是这些变异所处的位置。SpliceAI2 识别出的隐秘剪接变异中，约 50% 位于内含子区域深处，往往距离蛋白质编码序列数千个碱基之遥。这些变异特别难以检测和解读，因为它们位于以基因为中心的分析通常强调的区域之外，但它们却能创造出全新的剪接位点、改变转录本组成，并最终改变基因功能。这些发现再次印证了现代基因组学的一个重要教训：理解生物学需要超越基因组中直接编码蛋白质的那约 2%。

群体规模的 AI：SpliceAI2 做出的预测有进化和功能证据支持

SpliceAI2 在预测有影响的剪接变异方面的成功，促使 BioInsight AI Lab 测试该模型的预测能力在更大规模上是否依然成立。这一次，SpliceAI2 被应用于一个由 627,000 个样本基因组和 36,764 个样本蛋白质组组成的联合队列，数据取自 gnomAD、TOPMed 和 UK Biobank，以回答两个问题：

在数十万个基因组中，被预测为有害的变异在人类群体中是否确实罕见？
当这些变异存在时，被预测为有害的变异是否会减少所产生的蛋白质数量？

这两个问题都基于该领域的共识：真正有害的变异会降低适合度，由于负选择而在大群体中普遍罕见。其假设是，如果一个模型真正识别出有害变异，那么这些变异在基因型中以及在变异存在的罕见情况下随之而来的蛋白质组丰度中，都应较少被观察到。

结果提供了独立证据，表明 SpliceAI2 的预测对应着具有生物学意义的效应。被赋予最高 SpliceAI2 评分的变异在超过 627,000 个基因组中强烈缺失，接近蛋白质截短型功能丧失突变所观察到的缺失水平。独立的蛋白质组数据得出了相同结论：携带较高评分变异的个体一致表现出较低的血浆蛋白水平，且相关性比其他受测预测模型所观察到的更强（图 3）。总之，这些发现表明 SpliceAI2 评分捕捉到的是真实的生物学影响，而不仅仅是统计关联。它们还表明，该模型能够泛化到群体规模的遗传和蛋白质组数据集。

建模组织特异性剪接：SpliceAI2 捕捉组织特异性剪接差异

SpliceAI2 引入的另一个重要进展，是能够将剪接变异研究从影响预测推进到机制解释。该模型不再只是识别可能破坏剪接的变异，而是开始揭示驱动这些效应的调控因子和序列特征。RNA 结合蛋白的组织特异性表达，是细胞实现细胞类型特异性剪接活动的关键机制之一，而 SpliceAI2 在开发时正是考虑到了这一关键过程。SpliceAI2 整合了 147 个指导细胞剪接机器的剪接调控因子的实测活性水平。这使该模型不仅能够评估 DNA 序列，还能评估该序列所处的调控环境。在覆盖 48 种人类组织的近 1500 万次剪接位点差异使用测量中，SpliceAI2 准确捕捉到了 RNA 剪接的组织特异性模式。

重要的是，该模型在预测某一给定变异的影响如何在组织之间变化方面表现较差。相反，研究人员发现，组织特异性变异效应的最强预测因子是每个组织中已经存在的底层剪接程序，这凸显了细胞背景的重要性。当他们检查模型如何得出预测时，发现它已独立学习了许多真实剪接调控因子所识别的序列基序，并根据调控因子的丰度调整其重要性。该模型从未被明确教授这些关系。

总之，这些结果表明，SpliceAI2 学到的是支配 RNA 剪接的调控密码的某些方面，而不仅仅是记住结果。因此，该框架自然可以从健康组织扩展到疾病研究，成功模拟了影响剪接机器的癌症以及强直性肌营养不良等疾病中观察到的剪接紊乱。

协同更佳：与多个专用模型联合分析使高影响变异的识别数量翻倍

自人类基因组计划以来，多组学技术、分析方法和具有人群代表性的数据集的爆发式增长已使一件事变得清晰。任何单一变量都极难解释复杂的生物学。因此，BioInsight Lab 开发了多个专门的预训练 AI 模型，旨在利用它们的综合优势，同时理解产生表型和结果的诸多调控方面。

SpliceAI2 代表了细胞调控某一关键方面的重大进步。在 SpliceAI2 开发期间对 Genomics England 10 万基因组计划的分析所获得的生物学相关发现中，SpliceAI2 识别出的隐性剪接变异，在那些通过更明确的蛋白质破坏性突变即可识别的候选疾病相关变异之外，额外贡献了 15%。重要的是，整合其他 Illumina 模型（它们增加了额外的机制背景）后，可解释变异的数量约为仅使用传统方法的 2 倍（图 4）。总之，这些结果表明，需要更集成、更统一的分析能力，以扩大对更完整的高级注释工具库的获取。

扩大可及性：将先进的基因组解读带给更多研究人员

SpliceAI2、PrimateAI-3D、Promoter AI 以及许多其他 Illumina 分析工具旨在在基础研究和转化研究中实现最大程度的可及性，Illumina 正在创建多个访问入口，帮助研究人员将该模型整合到现有的分析工作流程中。BioInsight AI Lab 负责开发底层模型，而研究人员则通过 BioInsight 应用程序和软件产品来使用这些创新成果。

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SpliceAI2 将可通过 BioInsight 平台上的多个工具访问，包括：

DRAGEN Annotation——SpliceAI2 和多个其他高级注释工具现已集成到一个直观的应用程序中。
Emedgene——SpliceAI2 为 Emedgene 带来更高的置信度，这是一个可解释的 AI 驱动基因组解读平台，帮助转化研究人员对种系变异进行优先级排序和解释。
Illumina Connected Insights——SpliceAI2 进一步扩展了 ICI 基于云体系的体细胞变异分析、注释和证据审查流程中的 AI 驱动注释

源代码、训练模型以及人类基因体内每个可能的单核苷酸变异的预计算预测，以及人类群体中观察到的插入缺失，现也已在 GitHub 上提供（github.com/Illumina/SpliceAI2）。

与 BioInsight 合作

随着 BioInsight AI Lab 改进和开发新的高级注释工具，高质量训练数据的基础重要性变得异常清晰。该实验室产出的每个模型在与其训练数据相似的数据上表现最佳，因此训练数据的多样化和扩展对于进一步提升能力和准确性至关重要。

为加速这一关键领域的发展，BioInsight 欢迎合作机会，无论是针对 SpliceAI2 还是正在开发中的模型。请联系 BioInsight-Info@Illumina.com，咨询有关改善特定队列性能、罕见病研究、改善祖源代表性、模型评估、未来疗法研究或其他相关主题的事宜。

关于 BioInsight AI Lab

BioInsight AI Lab 开发基于序列的模型，用于解读整个基因组，包括非编码区域，而常见的解读框架在很大程度上仍围绕占基因组 2% 的蛋白质编码区域构建。SpliceAI2 延续了 SpliceAI⁶（此后已被纳入 ClinGen 的临床变异解读建议）、PrimateAI-3D⁷（针对改变蛋白质的变异）和 PromoterAI⁸（针对影响基因表达的变异）。每个模型都已发表，其方法和基准测试公开可供审查，并已发布以供独立评估——包括在本项工作中，由我们的学术合作者而非内部进行的 AlphaGenome 比较。

致谢

这项工作由 Kishore Jaganathan 和 Kyle Kai-How Farh 领导，Jianbin Chen、Xin Liu 和 Yan Zhang 为共同第一作者，与 Illumina 的同事以及牛津大学、UCSF 和纽约基因组中心的合作者共同完成。博客文章由 Laurel Mastro、Lisa Eldridge 和 Robert Yamulla 撰写。

我们感谢 Genomics England National Genomic Research Library 的参与者，以及 GTEx、gnomAD、TOPMed 和 UK Biobank 的捐赠者和参与者。我们感谢 ENCODE Consortium 提供用于转录本预测的长读长数据。

参考文献

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